甲基化是目前的研究熱點(diǎn),就我所做的一點(diǎn)工作并其中一點(diǎn)心得,與大家分享.希望能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭?一部分基因組DNA的提取.這一步?jīng)]有懸念,完全可以購買供細(xì)胞或組織使用的DNA提取試劑盒,如果實(shí)驗(yàn)室條件成熟,自己配試劑提取完全可以.DNA比較穩(wěn)定,只要在操作中不要使用暴力,提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的.

    此步重點(diǎn)在于DNA的純度,即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要.因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者.蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml;RNA酶要配制成不含DNA酶的RNA酶,即在購買市售RNA酶后進(jìn)行再處理,配制成10mg/ml.否則可能的后果是不僅沒有RNA,連DNA也被消化了.兩者均于-20度保存.

    紫外分光光度計計算OD比值;1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳.我傾向于第2種方法,這種方法完全可以明確所提基因組DNA的純度,并根據(jù)Marker的上樣量估計其濃度,以用于下一步的修飾.

    第2部分亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA如不特別指出,所用雙蒸水均經(jīng)高壓蒸汽滅菌.將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul;加5.5ul新鮮配制的3MNaOH;42℃水浴30min;10mM對苯二酚氫醌,加30ul至上述水浴后混合液中;溶液變成淡黃色.

    3.6M亞硫酸氫鈉,配制方法:1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋,并以3MNaOH滴定溶液至PH5.0,體積為5ml.這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶,但加入NaOH后會慢慢溶解,需要有耐心.PH一定要準(zhǔn)確為5.0.加520ul至上述水浴后溶液中.