(1)固體載體的選擇：許多物質(zhì)都可以作為固體載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、纖維素等。其形式可以是凹平板、試管、珠子等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。無論哪種載體，使用前都可以進行篩選：用等量的抗原包被，在相同的實驗條件下反應，觀察顯色反應是否均相，判斷其吸附性能好不好。

(2)包被抗體(或抗原)的選擇：抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度好，PH值一般在9.0-9.6之間。吸附溫度、時間和蛋白量也有一定影響，一般418 ~ 24小時。用不同濃度的蛋白質(zhì)(0.1、1.0和10g/ml等)包被后，應滴定很適濃度。)，在其他試驗條件相同的情況下，觀察陽性樣品的OD值。選擇OD值大，蛋白量zui小的濃度。對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，通常是1 ~ 10微克/毫升。

(3)酶標抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA試劑盒法滴定初始滴度(見酶標抗體部分)。然后固定其他條件或采用“方陣法”(包被、待測樣品對照品和酶標抗體分別有不同的稀釋度)在正式實驗體系中準確滴定其工作濃度。

(4)酶底物和供氫體的選擇：供氫體的選擇要求廉價、安全、顯色反應明顯，但無色。一些供氫體(如OPD等。)有潛在的致癌作用，要注意防護。如果條件允許，應使用非致癌、高靈敏度的供氫體。例如，TMB和ABTS目前是令人滿意的氫捐助國。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿來終止反應。