光片顯微鏡原理

    光片熒光顯微鏡，是一種新型的三維顯微成像技術(shù)，采用正交光路設(shè)計，用一層薄光片從側(cè)面激發(fā)樣品，并且在垂直于光片的方向上利用顯微物鏡和數(shù)字相機拍攝樣品的二維熒光圖像，通過軸向掃描光片或移動樣品逐面成像，獲取不同深度處的層析圖像實現(xiàn)樣品的三維重構(gòu)。

光片顯微鏡的優(yōu)勢

1. 大視野、成像速度快

光片顯微鏡采用的是高QE的CCD或者sCMOS相機，可以做到面成像，大大提高了成像的速度和圖像的信噪比。工作時，光片一次曝光穿過樣品，得到的光學(xué)切片可以得到在此平面上樣品的全部信息，大大減少了成像需要的時間。

2. 低光毒性、低光漂白

光毒性是指在較長時間的強光照射下，生物樣本細胞內(nèi)的熒光分子會產(chǎn)生分解現(xiàn)象。光漂白是指熒光成像的質(zhì)量很大程度上依賴于熒光信號強度，提高激發(fā)光強度固然可以提高信號強度，但當激發(fā)光的強度超過一定限度時，光吸收就趨于飽和，并不可逆地破壞激發(fā)態(tài)分子。

光片顯微鏡與傳統(tǒng)的熒光照明技術(shù)相比，光照是從樣品的側(cè)面發(fā)出，只會照亮平面上的樣品組織，這樣光毒性可以被降低很多倍，可以在更接近生理狀態(tài)的條件下，對活體生物樣品進行長時間的三維成像。

3. 對比度高

提高了圖像和背景的反差和軸向分辨率，光片照明技術(shù)使焦平面上下的樣品不會被激發(fā)。

樣品組織透明化

由于細胞中的色素及其它成分對光的散射和吸收，使光難以達到生物組織的深處。組織透明化技術(shù)（Tissue Clearing）是破解這一難題重要的技術(shù)手段之一。生物組織是由不同光學(xué)特性的非均質(zhì)成分組成，這會使入射光進入之后發(fā)生散射，限制光學(xué)成像的深度。對此，目前科研人員開發(fā)了三種組織透明化的方法。

①油性生物組織透明化方法

油性組織透明化主要是利用帶有高折射率介質(zhì)的光學(xué)透明劑取代組織中原本的水分和脂質(zhì)來平衡折射率，這種方法透明化效果較好，但是熒光蛋白容易被破壞，信號不易保存。

②水凝膠透明化方法

水凝膠方法主要是將樣品包埋在水凝膠中，使樣品中的蛋白質(zhì)和核酸分子與水凝膠形成共價連接，從而起到保護和固定作用。

③水性生物組織透明化方法

由于組織中的熒光蛋白分子帶有親水基團，所以與油性透明化方法相比，水性更利于熒光信號保存，但是也存在透明時間較長、透明度差等缺點。目前分為單純浸泡透明與高水化脫脂透明兩種方法。單純浸泡是利用滲透壓的原理，將組織樣品泡在高折射率溶液中，使得組織內(nèi)外被溶液被替換，從而平衡折射率。高水化法是利用氨基醇類與去垢劑類物質(zhì)將樣品組織的脂質(zhì)去除，然后利用水化作用降低樣品折射率實現(xiàn)組織透明化。