1、細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖擺促進(jìn)其融化。將融化的細(xì)胞移入離心管中，參加37℃預(yù)熱的DMEM完全培育基中（其中胎牛血清約為10%），悄悄吹勻，離心，500g離心2min，棄上清液。

參加DMEM徹底培育基清洗，棄上清液。參加DMEM徹底培育基，悄悄吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，接種于培育皿/瓶中，在含5% CO2的細(xì)胞培育箱中培育。

2、細(xì)胞傳代

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%（過早產(chǎn)值缺乏，過晚細(xì)胞狀態(tài)欠安，1:2至1:10以上的比率傳代培育，一般1:3至1:5細(xì)胞一代，即從細(xì)胞接種到別離再培育的一段時刻，非細(xì)胞有絲分裂次數(shù)）時，去掉徹底培育基，用1X PBS清洗2次。

參加胰蛋白酶（注意：消化液的量以蓋住細(xì)胞很好，很好的消化溫度是37℃。顯微鏡下調(diào)查細(xì)胞：倒置顯微鏡下調(diào)查消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此刻細(xì)胞消化適度）進(jìn)行消化，放入細(xì)胞培育箱中約2-3min。

參加適量DMEM徹底培育基停止胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再參加DMEM徹底培育基清洗，棄上清液。

參加DMEM徹底培育基，悄悄吹打混勻，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后依照所需細(xì)胞量在含5% CO2的細(xì)胞培育箱持續(xù)培育。

3、細(xì)胞凍存

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時，去掉徹底培育基，用1X PBS清洗2次。參加胰蛋白酶進(jìn)行消化，放入細(xì)胞培育箱中約2-3min。參加DMEM徹底培育基停止胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再參加DMEM徹底培育基清洗，棄上清液。參加lml凍存液（90%胎牛血清，10%DMSO。 一般來講血清含量能夠在10%-90%之間調(diào)整，凍存液中參加血清一方面可認(rèn)為細(xì)胞供給養(yǎng)分，另一方面能夠在細(xì)胞凍存過程中供給非滲透性維護(hù)物質(zhì)，如蔗糖，白蛋白等從而很好地維護(hù)細(xì)胞），放入凍存管內(nèi)（管內(nèi)有異丙醇，以確保溫度下降的速度），當(dāng)即放入4℃冰箱中凍存30min，然后放入-20℃冰箱中凍存30min，再置于-80℃冰箱內(nèi)過夜。然后放入液氮中，能夠保存至少兩年，如不放人液氮，能夠保存三個月。 

細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的原則是：慢凍速融，這樣也會有利于堅(jiān)持細(xì)胞的生機(jī)。凍存細(xì)胞不加任何維護(hù)劑，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，從而使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的機(jī)械損傷，引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境滲透壓，PH，電解質(zhì)等的改變，進(jìn)而促使細(xì)胞逝世。

4、注意事項(xiàng)

（1）預(yù)熱培育用液：把已經(jīng)制造好的裝有培育液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱；

（2）用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手；

（3）正確擺放運(yùn)用的器械：確保足夠的操作空間，不僅便于操作并且減少污染；

（4）點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太??；

（5）嚴(yán)厲的無菌操作；

（6）貼壁細(xì)胞消化適度：消化的時刻受消化液的品種、制造時刻、參加培育瓶中的量等諸多要素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培育細(xì)胞形狀的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松懈，或有成片浮起的痕跡就要當(dāng)即停止消化；

（7）傳代細(xì)胞一切的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次還是要只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作，每種細(xì)胞運(yùn)用一套器件。避免交叉感染；

（8）傳代細(xì)胞瓶口每次翻開或許封閉都需要在酒精燈上消毒。