由于遺傳特性不同，適合各種微生物的保存方法也不同。一種良好有效的保存方法，首先要能長期保持原菌種的優(yōu)異性質(zhì)不變，同時還要考慮方法的通用性、操作的簡單性和設(shè)備的普及性。以下是ATCC菌株的一些常用保存方法:

　　(一)斜面低溫保存法

　　將菌種接種在合適的斜面培養(yǎng)基上，待菌種完全生長后，放入4℃左右的冰箱中保存，每隔一段時間(保存期)轉(zhuǎn)移到新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保存，如此持續(xù)。

　　這種方法廣泛應(yīng)用于大多數(shù)微生物菌種的短期保存，如細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌，不適合冷凍和干燥。放線菌、霉菌和有芽孢的細(xì)菌一般可以保存6個月左右，無芽孢的細(xì)菌可以保存1個月左右，酵母可以保存3個月左右。如果用橡皮塞代替棉塞，用石蠟密封，放在4℃的冰箱里保存，不僅可以防止水分揮發(fā)和隔氧，還可以防止棉塞受潮和污染。這種改進(jìn)可以延長菌種的保質(zhì)期。

　　由于該方法采用低溫保存，微生物代謝繁殖速度大大降低，突變頻率降低;同時也減少了培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，使其不會干裂。這種方法的優(yōu)點是簡單易行，易于推廣，存活率高。因此，這種保存方法大多用于科學(xué)研究和生產(chǎn)中經(jīng)常使用的菌種。它的缺點是菌株仍然具有一定程度的代謝活動能力，保存期短，傳代次數(shù)多，菌株容易發(fā)生變異和污染。

　　(二)石蠟油密封法

　　這種方法是將滅菌、蒸發(fā)水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面(或半固體穿刺培養(yǎng)物)上，石蠟油層高于斜面頂部的lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔離，加入膠塞，用固體石蠟密封，然后垂直存放在室溫或4℃的冰箱中。使用的液體石蠟需要優(yōu)質(zhì)、無毒、純化學(xué)規(guī)格，滅菌條件如下:150～170℃烘箱內(nèi)滅菌lh;或者121℃高壓蒸汽滅菌60℃～80min，然后放在80℃的烤箱里烘干去除水分。

　　因為液體石蠟阻擋了空氣，使細(xì)菌處于缺氧狀態(tài)，防止水分揮發(fā)，使培養(yǎng)物不會開裂，因此可以使保質(zhì)期達(dá)到1?！珒赡?，或者更長。

　　這種方法操作簡單，適用于保存霉菌、酵母、放線菌、好氧細(xì)菌等。它對保存霉菌和酵母有很好的效果，可以保存幾年甚至10年。然而，它對許多厭氧細(xì)菌的保存效果很差，尤其是對一些能分解烴類的細(xì)菌。

　　根據(jù)實驗，這種方法適合保存紅曲霉，保存1～22年后的存活率為100%;還有報道顯示，部分細(xì)菌絲采用石蠟油保存法，3～菌絲在6℃保存時容易死亡，而在室溫下則比較理想，值得注意。

　　(三)砂土管保存法

　　這是一種常用的長期保存菌種的方法，適用于放線菌、霉菌和形成孢子的細(xì)菌，但不適用于奈氏球菌、弧菌、假單胞桿菌、酵母等一些對干燥敏感的細(xì)菌。

　　制作方法是先將砂和土分別清洗、干燥、過篩(一般砂采用60目篩，土采用120目篩)，按砂與土的比例(1。～2)：1混合均勻，分裝在小試管中，砂土高度約1cm，蒸汽滅菌121℃?！?.5h，間歇殺菌3次。50℃干燥后，檢查正確后備用。也有只用沙子或土壤作為載體保存的。需要保存的菌株先用斜面培養(yǎng)基充分培養(yǎng)，再用無菌水制成108～1010/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂管中，放線菌和霉菌也可以直接刮下孢子與載體混合，然后放入干燥器中抽真空約2?！男r內(nèi)，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，放置在干燥器內(nèi)，保存在室溫或4℃的冰箱內(nèi)，后者效果更好。

　　砂管法兼具低溫、干燥、隔氧、無營養(yǎng)等條件，因此保質(zhì)期長，效果好，微生物移接方便，經(jīng)濟簡單。它的保質(zhì)期比石蠟油密封法長，大約1。～十年。**科學(xué)院微生物研究所采用砂土管保存法保存放線菌。

　　(四)麩皮保存法

　　麩皮保存法又稱曲法保存法。也就是說，它以麩皮為載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。制作方法是將麩皮和水按一定比例按照不同菌種對水的要求進(jìn)行1。：(0.8～1.5)攪拌均勻，裝量為試管體積的2/5。濕熱滅菌后，冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子生長。將試管放入含有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，在室溫下干燥幾天，然后移至低溫保存;干燥后，試管也可以用火焰熔封，然后保存，這樣效果更好。

　　這種方法適用于孢子霉菌和一些放線菌的產(chǎn)生，保存期超過一年。由于操作簡單，經(jīng)濟實惠，廣泛應(yīng)用于工廠。**科學(xué)院微生物研究所采用麩皮保存法保存曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡曲霉等。，其保存期可達(dá)數(shù)年至數(shù)十年。

　　(五)甘油懸液保存法

　　這種方法是將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，低溫保存。這種方法比較簡單，但是需要配備低溫冰箱。如果保存溫度為-20℃，保存期約為0.5。～一年，而采用-70℃，保質(zhì)期可達(dá)10年。

　　將擬保存菌種對數(shù)期的培養(yǎng)液直接與甘油混合，甘油經(jīng)121℃蒸汽滅菌20分鐘，甘油濃度為10%?！?5%，再分裝在小離心管里，放在低溫冰箱里保存。這種方法經(jīng)常用于基因工程細(xì)菌的保存。

　　(六)冷凍真空干燥保存法

　　冷凍真空干燥保存法，又稱冷凍干燥保存法，簡稱冷凍干燥法。它通常用保護劑在安瓿管中制備細(xì)胞懸液或孢子懸液，然后在低溫下快速冷凍含菌樣品，減壓抽真空，使水升華干燥樣品脫水，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即密封，導(dǎo)致無氧真空環(huán)境。*放在低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，可長期保存。常用的保護劑包括脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。

　　因為這種方法同時具有低溫、干燥、缺氧的菌種保存條件，所以保存期長，一般達(dá)到5?！?5年來，存活率高，變異率低，是目前廣泛使用的理想保存方法。這種保存方法可用于大多數(shù)其他微生物，如病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等。，除了不產(chǎn)生孢子的絲狀真菌。但是這種方法操作繁瑣，技術(shù)要求高，需要凍干機等設(shè)備。

　　當(dāng)需要保存菌種時，可以在無菌環(huán)境下打開安瓿管，將無菌培養(yǎng)基注入安瓿管。固體菌塊溶解后，搖勻復(fù)水，然后在適合菌種生長的斜面上接種，適當(dāng)溫度培養(yǎng)。

　　(七)液氮超低溫保存法

　　液氮超低溫保存法，簡稱液氮保存法或液氮保存法。它是以甘油、二甲基亞邈等為保護劑，在液氮超低溫(-196℃)下保存的一種方法。其主要原理是菌種細(xì)胞從常溫過渡到低溫，使細(xì)胞內(nèi)的自由水在降低到低溫前通過細(xì)胞膜滲出，避免細(xì)胞因自由水凝結(jié)成冰晶而損傷膜內(nèi)的細(xì)胞。當(dāng)美國ATCC菌種保存中心采用這種方法時，通過控制菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊的冷卻速度，每分鐘降低1℃/分鐘的速度從0℃降至-35℃，然后保存在-150℃?！?196℃液氮冷箱。如果冷卻速度太快，冰晶會損傷細(xì)胞，因為細(xì)胞內(nèi)的自由水沒有時間滲出細(xì)胞。據(jù)研究，冷卻速度控制在(1)～10)℃/min，細(xì)胞性死亡率低;死亡率隨著速度的加快而相應(yīng)增加。

　　低溫保存液氮的保護劑一般選用甘油、二甲基亞邈、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環(huán)、吐溫80等，但常用甘油(10%)～20%)。不同的微生物應(yīng)該選擇不同的保護劑，然后通過實驗確定保護劑的濃度。原則上，保護劑的濃度應(yīng)控制在不足以導(dǎo)致微生物死亡的濃度。

　　這種方法操作簡單、高效、保存期一般可達(dá)15年以上，是目前公認(rèn)的*有效菌種長期保存技術(shù)之一。該方法適用于保存各種微生物菌種，甚至藻類、原生動物、支原體等。用于有效保存。這種方法的另一個主要優(yōu)點是可以用各種培養(yǎng)形式的微生物來保存，這種保存方法可以用于孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物。其缺點是需要購買超低溫液氮設(shè)備，液氮消耗大，運行成本高。

　　使用菌種時，將安瓿瓶從液氮罐中取出，迅速放入35～在40℃的溫水中，冷凍熔化，無菌操作打開安瓿瓶，移到保存前使用的同一培養(yǎng)基的斜面上進(jìn)行培養(yǎng)。從液氮罐中取出安瓿瓶時，速度要快，一般不超過1分鐘，防止其他安瓿瓶升溫，影響保存質(zhì)量。而且取樣時一定要戴專用手套，防止意外爆炸和凍傷。

　　(八)宿主保存法

　　這種方法適用于專用活細(xì)胞寄生微生物(如病毒、立克次氏體等)。).它們只能寄生在活動植物或其他微生物體內(nèi)，因此可以根據(jù)宿主細(xì)胞的特性進(jìn)行保存。例如，植物病毒可以通過混合植物幼葉的汁液、冷凍或干燥來保存。噬菌體可以通過細(xì)菌培養(yǎng)擴大后直接與培養(yǎng)基混合保存。動物病毒可以直接用病毒感染合適的器官或體液，然后裝入試管中密封，低溫保存。

　　在上述菌種保存方法中，以斜面低溫保存方法、石蠟油密封方法、宿主保存方法*為簡單，其次是砂管保存方法、麩皮保存方法和甘油懸液保存方法;冷凍真空干燥保存方法和液氮超低溫保存方法復(fù)雜，但保存效果好。應(yīng)用時可根據(jù)實際需要選擇。

　　“美國典型培養(yǎng)物收藏中心”(簡稱ATCC)是國際著名的“美國典型培養(yǎng)物收藏中心”，只采用兩種有效的保存方法，即保存期一般達(dá)到5?！?5年冷凍真空干燥保存法和液氮超低溫保存法一般達(dá)到15年以上的保存期，以大限度地減少傳代次數(shù)，避免菌種變異和衰退。中國的菌種保存多采用三種方法，即斜面低溫保存法、液氮超低溫保存法和冷凍真空干燥保存法。